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miArrest? miRNA抑制劑
miArrest? miRNA抑制劑
miRNA抑制劑可以特異、高效地抑制生物體內(nèi)源性miRNA的活性，是研究miRNA功能缺失的重要工具。復能基因提供慢病毒或非病毒載體的miArrest? miRNA抑制劑表達克隆和化學合成的miRNA抑制劑。miArrest? miRNA抑制劑克隆可以特異性地結(jié)合目的miRNA，瞬時和穩(wěn)定地抑制miRNA的功能，采用H1或者U6啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)錄可以保證在大多數(shù)哺乳動物細胞中高水平表達。
圖1. 不同劑量miArrest? miRNA抑制劑克隆對靶miRNA抑制作用的對比
HEK293細胞中共轉(zhuǎn)染miR-125a 抑制劑表達質(zhì)粒 (GeneCopoeia HmiR-AN0094-AM01) 、miR-125a 前體表達質(zhì)粒(GeneCopoeia HmiR0309-MR03) 和miR-125a的靶標克隆質(zhì)粒(GeneCopoeia HmiT019205-MT02：將LIN28 的3’UTR克隆到Gaussia熒光素酶-堿性磷酸酶雙報告載體)。轉(zhuǎn)染24小時后檢測報告基因Gaussia 熒光素酶和參照基因堿性磷酸酶的活性。只轉(zhuǎn)染Gluc-LIN28-3’-UTR質(zhì)粒的細胞中Gaussia 熒光素酶與堿性磷酸酶活性比值設為1 (左數(shù)第一條柱)，用來標準化其他細胞樣品中的報告基因活性。結(jié)果表明miR-125a抑制了Gluc-LIN28-3’-UTR中Gluc 70%以上的活性（左數(shù)第二條柱）。這種抑制效應可被導入的不同劑量的miR-125a抑制劑表達質(zhì)粒特異性的阻遏。轉(zhuǎn)染100 ng 抑制劑表達質(zhì)粒時，細胞內(nèi)報告基因/參照基因活性比值（右數(shù)第一條）已超出單獨轉(zhuǎn)染Gluc-LIN28-3’-UTR報告質(zhì)粒的對照組。這說明miR-125a抑制劑可以阻遏外源和內(nèi)源性的miR-125a對靶標基因的抑制，提高GLuc-LIN28-3’-UTR轉(zhuǎn)錄本的翻譯水平。
表1. 基于克隆表達載體的和化學合成的miRNA抑制劑的比較
圖2. miRNA抑制劑表達克隆的作用機理
miRNA 抑制劑克隆導入細胞后表達的miRNA抑制劑(miArrest)特異地結(jié)合它們的靶miRNA。miRNA抑制劑轉(zhuǎn)錄后折疊形成一個穩(wěn)定的陷阱結(jié)構(gòu)，可以結(jié)合兩分子靶miRNA。miArrest?高效、特異地結(jié)合細胞內(nèi)成熟的靶miRNA，阻止了miRNA對靶標mRNA的降解或者翻譯抑制，上調(diào)miRNA靶標基因的表達。獨特的載體設計確保最大的特異性、抑制強度、抑制作用持久度和最低的脫靶效應。