IndelCheck? CRISPR/TALEN 插入缺失檢測(cè)體系

復(fù)能基因開發(fā)的 IndelCheck? CRISPR/TALEN 插入缺失檢測(cè)體系能為您的基因組編輯研究提供強(qiáng)大的助力。 IndelCheck 檢測(cè)體系主要可用于以下兩方面應(yīng)用：

    CRISPR sgRNA 或 TALEN 功能驗(yàn)證（圖 1） ：在進(jìn)行需時(shí)較長(zhǎng)的基因組編輯項(xiàng)目之前（基因組編輯細(xì)胞株通常需時(shí)3-6個(gè)月，基因組編輯小鼠模型通常需時(shí)6-9個(gè)月），先進(jìn)行功能驗(yàn)證預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)芘懦羟行什患训?CRISPR sgRNA 或 TALEN設(shè)計(jì)，節(jié)省大量實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

    篩選基因敲除或敲入陽(yáng)性的單克隆細(xì)胞株（圖 2）。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

    簡(jiǎn)化您的 CRISPR/TALEN 功能驗(yàn)證及基因敲除克隆篩選

    靶點(diǎn)序列 PCR 擴(kuò)增能力強(qiáng)大，無需分離基因組

    優(yōu)化過的 T7 核酸內(nèi)切酶 I 檢測(cè)系統(tǒng)，含陽(yáng)性對(duì)照，易于上手

應(yīng)用 1: CRISPR sgRNA/TALEN 功能驗(yàn)證

圖 1. 使用IndelCheck?體系對(duì) CRISPR 或 TALEN 進(jìn)行功能驗(yàn)證。收集經(jīng) CRISPR 或 TALEN 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并針對(duì)靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，使用靶點(diǎn) PCR 試劑盒（1）擴(kuò)增經(jīng)過 CRISPR/TALEN 擴(kuò)增的靶點(diǎn)序列。所得的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)解鏈退火生成雜交 DNA 雙鏈產(chǎn)物，其中部分部分可能存在錯(cuò)配，可以被 T7 核酸內(nèi)切酶 I 試劑盒（2）酶切檢出。如果 CRISPR/TALEN 對(duì)基因組的編輯功能是陽(yáng)性的，錯(cuò)配酶切所產(chǎn)生的條帶可以通過電泳跑膠觀察到。

應(yīng)用 2: 篩選 CRISPR 或 TALEN 介導(dǎo)的基因組修飾

圖 2. 使用 IndelCheck? 體系篩選帶有目的基因組修飾的單克隆細(xì)胞株。接種經(jīng) CRISPR 或 TALEN 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并挑取單克隆細(xì)胞株，然后針對(duì)靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，使用靶點(diǎn) PCR 試劑盒（1）擴(kuò)增經(jīng)過 CRISPR/TALEN 擴(kuò)增的靶點(diǎn)序列。左側(cè)的流程用于篩選非同源末端連接（NHEJ）機(jī)制介導(dǎo)的基因敲除克隆，利用 T7 核酸內(nèi)切酶 I 檢測(cè)試劑盒（2）對(duì)靶點(diǎn) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行錯(cuò)配酶切，檢測(cè)NHEJ機(jī)制引入的插入缺失突變；檢測(cè)陽(yáng)性的 PCR 產(chǎn)物通過靶點(diǎn) PCR 克隆試劑盒（3）裝載體送測(cè)，對(duì)引入的突變進(jìn)行測(cè)序確證。右側(cè)的流程用于鑒別基因敲除或基因敲入修飾，使用靶點(diǎn) PCR 克隆試劑盒（3）將靶點(diǎn) PCR 產(chǎn)物裝載體送測(cè)，檢測(cè)和確證靶點(diǎn)引入的基因組修飾。

以下圖片是使用 IndelCheck? 靶點(diǎn) PCR 試劑盒及 T7 核酸內(nèi)切酶 I 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行的一個(gè)典型的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：

圖 3. T7 核酸內(nèi)切酶 I 酶切基因組PCR產(chǎn)物。該基因組經(jīng)CRISPR-Cas9編輯。 對(duì)照細(xì)胞（-）的酶切產(chǎn)物應(yīng)只有一條帶，對(duì)應(yīng)沒有被切開的基因組PCR產(chǎn)物。轉(zhuǎn)染了有活性的CRISPR-Cas9克隆的實(shí)驗(yàn)組（+），酶切產(chǎn)物跑膠出現(xiàn)3條帶：1條來自未被編輯的細(xì)胞的基因組PCR產(chǎn)物，其余兩條較短的條帶為長(zhǎng)度符合預(yù)期的錯(cuò)配酶切產(chǎn)物。

圖 4. Smart-Join? Blunt-end PCR Cloning Kit的性能比較。 將多組不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化涂板，然后檢測(cè)菌落總數(shù)和陽(yáng)性率。 顯示SmartJoin? Target Site PCR Cloning Kit（GeneCopoeia, Cat.No.IC007）的連接效率與Zero Blunt? PCR Cloning Kit（Thermo Fisher, Cat.No.K275020）相當(dāng)。

圖 5. 多組Control Insert連接產(chǎn)物凝膠電泳圖

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細(xì)胞的鑒定和篩選